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β-受体激动剂类药物残留量的测定公定方法(四)

时间:2023-03-25 08:10:29来源:food栏目:食品快速检测 阅读:

 

β-受体激动剂类药物残留量的测定公定方法(四)

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

1.2.1.7 分析条件的选择

(1)提取净化条件的选择

1)提取溶剂的选择

β-兴奋剂的提取方法主要有液液提取法和固相提取法(SPE)。除饲料中因直接添加β-兴奋剂外,β-兴奋剂在生物体内经过吸收、转化、代谢,部分β-兴奋剂可能成为结合型,如与葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相结合。Boyd等l曾做过对比试验,比较有无酶水解步骤对沙丁胺醇测试结果的影响,结果发现,酶水解后所测得的结果明显高于未水解的(采用RIA方法测试),有40%~45%沙丁胺醇是以结合物形式存在于肝样品中。而Haasnoot等山报道,费诺特罗在尿样中大约85%是以葡糖苷酸酶化-硫酸酯蛋白化结合物形式存在,但是对于克伦特罗没有数据证明是以结合的形式存在。

水解主要包括酸解和酶解。酶制剂本身及其水解的样品往往可产生大量干扰物质,且酶解条件受酶种类、样品基质及水解条件不同而有所不同,而酸解的分析结果与酶解相近,且产生的干扰物质较少。本方法采用酸解方式进行水解,除使可能以结合态形式存在的化合物游离出来外,同时也使样品基质分散,便于提取。

样品中β-兴奋剂常见的提取溶剂有甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙酸乙酯-异丙醇、乙酸乙酯-正丁醇等。本方法结合12种β-兴奋剂不同的极性,采用不同比例的乙酸乙酯-异丙醇进行提取(添加水平5.0ug/kg,提取一次),结果见表1-6,如果提取溶剂中异丙醇比例过高,会出现不容易分层,而且浓缩不干的情况,所以,本实验中采用15mL乙酸乙酯-异丙醇(4+6,v/v)提取一次后,再采用10mL乙酸乙酯-异丙醇(7+3,v/v)进行提取,提取回收率比较好,而且容易操作。

表1-6不同比例的乙酸乙酯-异丙醇混合溶剂对β-兴奋剂的提取回收(添加水平5.0ug/kg)

2)pH的选择

根据β-兴奋剂在酸性情况下溶于水溶液,在碱性情况下溶于有机溶剂,本实验中将12种β-兴奋剂在不同pH的乙酸钠缓冲液(0.2mol/L)用乙酸乙酯-异丙醇(4+6,v/v)进行提取,得到结果见图1-6(添加水平10.0ug/kg),因此本方法中调节pH为9.4~10范围内进行有机溶剂的提取,提取效率对12种β-兴奋剂都较为稳定。

图1-6 β-兴奋剂在不同pH的提取回收情况

3)净化方法

β-兴奋剂最常用的净化手段是固相萃取法(SPE)、免疫亲和色谱法(IAC)和液液净化法等。常用于β-兴奋剂提取的固相柱有硅藻土、C2、C8、C18、硅胶、强阳离子交换柱和弱阳离子交换柱等,所用的SPE柱有Bond Elut C18柱、C18和硅酸柱、酸洗硅酸柱、Bond-EIm Certify柱、Clean screen DAU cartridge柱等,也有用C18柱与SCX离子交换树脂串联的净化方法。本方法采用C18与SCX结合性质的Oasis MCX固相萃取柱,取得了良好的净化效果,并比较了Oasis MCX与SCX的洗脱曲线,见图1-7。从图1-7中可以看出,至少要6mL 5%氨水甲醇溶液才能完全洗脱SCX柱上的沙丁胺醇。因此,实验中采用5%氨水甲醇溶液5mL洗脱,12种β-兴奋剂都取得了较好的回收率。

4)过滤膜的影响

取含12种β-兴奋剂的标准溶液分别过0.22um有机相和水相滤膜,发现有机相滤膜对克伦特罗,妥布特罗有明显的吸附作用,而过水相滤膜基本上没有损失,因此本方法采用过水相滤膜后进样。

图1-7 12种β-兴奋剂在MCX与SCX固相萃取柱上的洗脱曲线

洗脱溶剂:5%氨水甲醇溶液,1~3为淋洗液,4~12为洗脱液

5)基质干扰实验

因上样液中的杂质对β-兴奋剂药物的检测有一定基质效应,所以本方法中的标准曲线都是以空白基质的提取液来稀释和配置的。

(2)仪器条件的选择

1)内标法和外标法的比较

由于所分析的12种化合物的结构差异比较大,研究中对内标法和外标法定量进行了比较,由于尚不能获得12种化合物的同位素内标,本方法采用莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇三种同位素内标,实验证明内标法定量准确性明显高于外标法,尤其是对沙丁胺醇和特布它林这种绝对回收率较低的药物,回收率明显改善,这主要是由于同位素内标能很好地校正方法过程中的损失,以及基质带来的干扰和影响。因此,选择内标法定量。

2)检测条件的确定

按照质谱测定的一般要求,先对各化合物进行全扫描,随后对每个化合物确定扫描离子,采用选择离子模式以提高其检测灵敏度。选择两对离子进行MRM监测即可满足,其中母离子和子离子按照每种化合物的质谱图和结构特性选取。

在所分析的化合物中,各物质极性强弱不同,如特布它林、沙丁胺醇等含有极性较强的酚羟基官能团,而克伦特罗和莱克多巴胺极性相对较弱,因此需要采用梯度洗脱方式来进行分离。试验证明,在梯度洗脱条件下这12种物质均能较好分离。

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